Kontrola kvality barvení krevních nátěrů
metodou May-Grünwald-Giemsa

Zpracovaly: L. Bourková, M. Matý?ková

Text pro?el připomínkovým řízením v laboratorní sekci a byl schválen na schůzi výboru České hematologické společnosti dne 02.11.2005

Hodnocení krevních nátěrů je nejroz?ířeněj?í morfologické vy?etření. Slou?í k vyhledávání, diagnostice a monitorování řady onemocnění.

I na toto vy?etření se vztahují podmínky pro minimální po?adavky na kontrolu kvality. Dodr?ováním vlastních standardních operačních postupů a následujících doporučených bodů lze potom v nabarvených nátěrech předejít vzniku četných artefaktů.

Preventivní zásady pro správné barvení:

1. Správné a dostatečné zaschnutí nátěru

2. Zamezení vlhkostí v roztocích a na nátěru (ji? 1% příměs vody v metanolu mů?e znemo?nit správnou interpretaci vy?etření, zvlá?tě morfologie erytrocytů)

3. Správné provedení nátěru

4. Pří manuálním barvení je nutné pracovat v uzavřených kyvetách (ne na mří?ce): předchází se tím vypařování metanolu (pozor také na toxické výpary) a vysrá?ení barev na sklíčkách.
   Při práci s barvícími automaty je třeba s ostatními zásadami také dodr?ovat i pokyny výrobce.

5. Včasná fixace: nejlépe barvit nátěry ihned po zaschnutí
   -pokud toto není mo?né, potom je vhodné nátěry nejpozději do 4 hodin po natření a zaschnutí fixovat metanolem (optimální je provést fixaci do jedné hodiny od zhotovení nátěru) - fixované nátěry je mo?né skladovat po neomezenou dobu.

6. Pou?ití čerstvě naředěných barvících roztoků.
   Pou?itelnost roztoku je dána počtem nabarvených skel, ale roztok nemá být pou?íván déle jak 24 hodin. Barví-li se v průběhu dne vět?í počet skel, doporučuje se připravit čerstvé roztoky i dvakrát za den.
   

Před barvením nátěru je třeba kontrolovat:

1. kvalitu skel (nepou?ívat po?kozená, za?piněná, zama?těná skla apod.), délku, ?ířku a sílu nátěru

2. dodr?ování doby exspirace v?ech reagencií (pozor na případně vysrá?ené barvící roztoky),

3. skladování reagencií - vedle splnění po?adavků výrobce je vhodné

4. barvící roztoky uchovávat ve tmě
   -při skladování diagnostik dodr?ovat předepsanou teplotu - změna teploty mů?e způsobit vysrá?ení barvících roztoků:
   -barvící roztoky nesmí zmrznout, proto pozor na přepravu reagencií v zimních měsících
   - reagencie nesmí být vystaveny vy??ím teplotám - dochází k vypařování roztoků

5. dostatečné mno?ství fixačních a barvících roztoků a pufrů v kyvetách

6. kontrola pufru
   -makroskopická: pufr - bez viditelných příměsí a změn (vysrá?ené soli, plíseň)
   -pH

Kontrola po nabarvení nátěru:

Preventivní kontrolu je nutné provádět s ka?dou novou sérií připravených fixačních a barvících roztoků a v první barvené sadě skel. Pro tuto kontrolu pou?ijeme nátěr krve od zdravého jedince, případně od vhodného pacienta. Nátěr hodnotíme makroskopicky a mikroskopicky. Jestli?e jsou barevné reakce ,,správné" (viz dále), potom lze kontrolu kvality akceptovat.

Sledujeme:

1. Makroskopicky:

-krevní nátěry mají být zbarveny purpurově

- je-li zbarvení nátěru do modra, pufr má vy??í hodnotu pH nebo nátěr je přebarvený

- jeli zbarvení do rů?ová, pufr má ni??í hodnotu pH nebo nátěr je nedobarvený

-odstíny zbarvení nátěrů se mohou v jednotlivých laboratořích li?it

2. Mikroskopicky mají být:

- Erytrocyty rů?ovo?edé,

- Trombocyty tmavě rů?ové,

- Leukocyty - jádra tmavě fialová

- Eozinofily - granula jasně oran?ová

- Neutrofily a granulované lymfocyty - granula purpurová

- Bazofolní tečkování erytrocytů má být modré.

3. Zbarvení nátěrů je dáno:

- vlastním barvením a barvícími roztoky,

- typem biologického materiálu (periferní krev, kostní dřeň)

- vlastnostmi biologického materiálu (vysoký či nízký hematokrit, hyperproteinémie, buněčnost).

Jestli?e jsou na nátěrech patrné rozdíly v barvitelnosti buněk (viz vý?e) ve stejném barvícím cyklu a ve stejné barvící lázni, potom je barvení v pořádku a změny v obarvení jednotlivých nátěrů jsou dány typem odebraného biologického materiálu (výsledek barvení mů?e být ovlivněn i buněčným slo?ením).

Uchování nátěrů

1. nenabarvené, nefixované - vhodné zpracovat do 4 hodin

2. nenabarvené, fixované - je mo?né uchovávat po neomezenou dobu

3. nabarvené - - je mo?né uchovávat po neomezenou dobu

Pro uchovávání obarvených nátěrů je nezbytné zbavit nátěr imerzního oleje oplachem nebo otěrem (?etrný prostředek je např. ether). Zbytky oleje mohou buňky znehodnotit (dle typu oleje ji? druhý den). Imerzních olejů je několik druhů a jsou různé kvality. Před pou?itím je vhodné kvalitu oleje otestovat.

Kontrola zařízení:

1. Pro správné hodnocení nátěrů je potřeba mikroskopy pravidelně čistit, seřizovat a kontrolovat mechanické a optické části (v zahraniční literatuře se pou?ívá pojem kalibrace). Údr?bu mikroskopů je vhodné provádět 1x ročně servisním technikem, ale tento interval je velmi individuální a závisí na frekvenci jeho pou?ití, stáří a kvalitě. Pokud mikroskop není tak často pou?íván, je nutné zvá?it jiný pravidelný interval.

2. Objektivy je nutné čistit po ka?dém pou?ití a řídit se doporučením firmy.

Dokumentace:

O kontrolách barvení i zařízení je nutné provádět autorizované záznamy (např. provozní deníky, formuláře).

Literatura:

· Houwen B, Blood Film Praparation and Staining Procedures, Laboratory Hematology 6, 2000, s.1-7.

· Garcia, L. S. Diagnostic Medical Parasitology, ed. 4, ASM Press, Washington, D.C. 2001.

· NCCLS: Laboratory Diagnosis of Blood-Borne Parasitic Diseases. Approved Guideline M15-A. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova PA 2000.

· Brown, A. B.: Hematology: principles and procedures, ed. 6, Lea & Fabiger, Philadelphia, London 1993.