Kontrola kvality barvení krevních nátěrů
metodou May-Grünwald-Giemsa
Zpracovaly: L. Bourková, M. Matýšková
Text prošel
připomínkovým řízením v laboratorní sekci a byl schválen na schůzi výboru České
hematologické společnosti dne 02.11.2005
Hodnocení
krevních nátěrů je nejrozšířenější morfologické vyšetření. Slouží k vyhledávání,
diagnostice a monitorování řady onemocnění.
I na toto
vyšetření se vztahují podmínky pro minimální požadavky na kontrolu kvality.
Dodržováním vlastních standardních operačních postupů a následujících
doporučených bodů lze potom v nabarvených nátěrech předejít vzniku četných
artefaktů.
Preventivní
zásady pro správné barvení:
-
Správné
a dostatečné zaschnutí nátěru
-
Zamezení
vlhkostí v roztocích a na nátěru (již 1% příměs vody v metanolu může znemožnit
správnou interpretaci vyšetření, zvláště morfologie erytrocytů)
-
Správné provedení nátěru
-
Pří
manuálním barvení je nutné pracovat v uzavřených kyvetách (ne na mřížce):
předchází se tím vypařování metanolu (pozor také na toxické výpary) a
vysrážení barev na sklíčkách.
Při práci s barvícími automaty je třeba s ostatními zásadami také dodržovat i
pokyny výrobce.
-
Včasná fixace:
nejlépe barvit
nátěry ihned po zaschnutí
-pokud toto není možné, potom je
vhodné nátěry nejpozději do 4 hodin po natření a zaschnutí fixovat metanolem
(optimální je provést fixaci do jedné hodiny od zhotovení nátěru)
-
fixované nátěry je možné skladovat
po neomezenou dobu.
-
Použití čerstvě naředěných
barvících roztoků.
Použitelnost roztoku je dána počtem
nabarvených skel, ale roztok nemá být používán déle jak 24 hodin. Barví-li se
v průběhu dne větší počet skel, doporučuje se připravit čerstvé roztoky i
dvakrát za den.
Před
barvením nátěru je třeba kontrolovat:
-
kvalitu skel (nepoužívat
poškozená, zašpiněná, zamaštěná skla apod.),
délku, šířku a sílu
nátěru
-
dodržování doby
exspirace všech reagencií (pozor na případně vysrážené barvící roztoky),
-
skladování reagencií
– vedle splnění požadavků výrobce je vhodné
-
barvící roztoky
uchovávat ve tmě
-při skladování
diagnostik dodržovat předepsanou teplotu – změna teploty může způsobit
vysrážení barvících roztoků:
-barvící
roztoky nesmí zmrznout, proto pozor na přepravu reagencií v zimních měsících
-
reagencie nesmí být
vystaveny vyšším teplotám – dochází k vypařování roztoků
-
dostatečné množství
fixačních a barvících roztoků a pufrů v kyvetách
-
kontrola pufru
-makroskopická: pufr
- bez viditelných příměsí a změn (vysrážené soli, plíseň)
-pH
Kontrola po nabarvení nátěru:
Preventivní kontrolu je nutné
provádět s každou novou sérií připravených fixačních a barvících roztoků a
v první barvené sadě skel. Pro tuto kontrolu použijeme nátěr krve od zdravého
jedince, případně od vhodného pacienta. Nátěr hodnotíme makroskopicky a
mikroskopicky. Jestliže jsou barevné reakce „správné“ (viz dále), potom lze
kontrolu kvality akceptovat.
Sledujeme:
1.
Makroskopicky:
-krevní nátěry mají být
zbarveny purpurově
-
je-li zbarvení nátěru
do modra, pufr má vyšší hodnotu pH nebo nátěr je přebarvený
-
jeli zbarvení do
růžová, pufr má nižší hodnotu pH nebo nátěr je nedobarvený
-odstíny zbarvení
nátěrů se mohou v jednotlivých laboratořích lišit
2.
Mikroskopicky mají být:
-
Erytrocyty růžovošedé,
- Trombocyty tmavě
růžové,
- Leukocyty – jádra tmavě
fialová
-
Eozinofily – granula
jasně oranžová
-
Neutrofily a
granulované lymfocyty – granula purpurová
-
Bazofolní tečkování
erytrocytů má být modré.
3.
Zbarvení nátěrů je dáno:
-
vlastním barvením a
barvícími roztoky,
-
typem biologického
materiálu (periferní krev, kostní dřeň)
-
vlastnostmi
biologického materiálu (vysoký či nízký hematokrit, hyperproteinémie, buněčnost).
Jestliže jsou na nátěrech patrné
rozdíly v barvitelnosti buněk (viz výše) ve stejném barvícím cyklu a ve stejné
barvící lázni, potom je barvení v pořádku a změny v obarvení jednotlivých nátěrů
jsou dány typem odebraného biologického materiálu (výsledek barvení může být
ovlivněn i buněčným složením).
Uchování nátěrů
1.
nenabarvené, nefixované – vhodné zpracovat do 4 hodin
2.
nenabarvené, fixované – je možné uchovávat po neomezenou dobu
3.
nabarvené - – je možné uchovávat po neomezenou dobu
Pro uchovávání obarvených nátěrů je
nezbytné zbavit nátěr imerzního oleje oplachem nebo otěrem (šetrný prostředek je
např. ether). Zbytky oleje mohou buňky znehodnotit (dle typu oleje již druhý
den). Imerzních olejů je několik druhů a jsou různé kvality. Před použitím je
vhodné kvalitu oleje otestovat.
Kontrola zařízení:
1. Pro správné hodnocení nátěrů je potřeba mikroskopy pravidelně čistit,
seřizovat a kontrolovat mechanické a optické části (v zahraniční literatuře se
používá pojem kalibrace). Údržbu mikroskopů je vhodné provádět 1x ročně
servisním technikem, ale tento interval je velmi individuální a závisí na
frekvenci jeho použití, stáří a kvalitě. Pokud mikroskop není tak často
používán, je nutné zvážit jiný pravidelný interval.
2. Objektivy je nutné čistit po každém použití a řídit se doporučením firmy.
Dokumentace:
O kontrolách
barvení i zařízení je nutné provádět autorizované záznamy (např. provozní
deníky, formuláře).
Literatura:
·
Houwen B, Blood Film
Praparation and Staining Procedures, Laboratory Hematology 6, 2000, s.1-7.
·
Garcia, L. S.
Diagnostic Medical Parasitology, ed. 4, ASM Press, Washington, D.C. 2001.
·
NCCLS: Laboratory
Diagnosis of Blood-Borne Parasitic Diseases. Approved Guideline M15-A. National
Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova PA 2000.
·
Brown, A. B.:
Hematology: principles and procedures, ed. 6, Lea & Fabiger, Philadelphia,
London 1993.